北京2024年9月12日 /美通社/ -- 載體構建是蛋白表達等很多實驗的起點，也許你知道可以通過優化啟動子、調整表達載體、選擇合適的宿主細胞、控制培養條件等來提高蛋白表達量，但你是否關注過密碼子優化這個關鍵步驟呢？當遇到片段擴增失敗，或載體難構建的情況，也許你會不停優化引物設計、或更換試劑，你是否知道可以通過序列優化增加載體構建成功率呢？
在理解密碼子優化的重要性之前，需先了解密碼子在基因表達中的作用。DNA序列通過轉錄和翻譯產生蛋白質，而每個密碼子由三個核苷酸組成，指定一個特定的氨基酸。這種對應關系在密碼子表中明確列出，例如，密碼子"ATG"編碼甲硫氨酸（Met），開始蛋白質的合成。苯丙氨酸（Phe）對應的密碼子有UUU和UUC，而終止密碼子包括UAA、UAG和UGA。這種精確的編碼方式確保了蛋白質合成的準確性和特異性?。
圖1.密碼子表
雖然不同的密碼子可編碼相同的氨基酸，但不同生物體對密碼子的使用存在偏好。這種偏好與每個生物體內特定tRNA的豐度相關。基因表達水平與密碼子偏好性之間存在強相關性，同一氨基酸在不同宿主中，其對應的密碼子會表現出不同程度的偏好[1]。因此，直接使用未優化的基因序列可能導致外源基因在宿主，特別是異源宿主中的表達效率低下。
密碼子優化（codon optimization）是在不改變基因編碼蛋白質的前提下，通過調整基因編碼序列中的密碼子使用頻率，使用物種偏好密碼子并避免稀有密碼子得到優化序列，來提高外源基因在宿主細胞中表達水平的技術[2]。
對于自己構建載體的客戶來說，是無法進行密碼子優化的，因此采用基因合成方法來構建載體就成為了首選。
序列優化涉及更廣泛的序列調整，包括優化GC含量、避免重復序列、消除不利的mRNA二級結構等，目的是提高整個基因的穩定性和表達效率，同時不改變最終編碼的氨基酸序列。
（1）密碼子偏好性
密碼子適應指數CAI是指異源mRNA序列中密碼子和宿主細胞最佳密碼子使用頻率相符合的程度，理論上此值越接近1，外源mRNA在宿主細胞中的蛋白表達越高，通常CAI＜0.8時，被認為需要進行密碼子優化。使用宿主細胞中使用頻率高的同義密碼子替換外源mRNA序列中的密碼子，例如，在大腸桿菌中，某些密碼子如TAA和TAG可能很少使用，而GCA（編碼丙氨酸）的使用頻率較高。且避免出現稀有密碼子，稀有密碼子可能導致翻譯停頓，增加翻譯時的錯誤率，從而降低蛋白質產量。同時考慮高頻和次高頻的密碼子組合。
注意CAI值過高可能導致外源基因在宿主細胞中過度表達，進而使得蛋白質在合成過程中積累過快，無法正確折疊，從而形成包涵體。包涵體是指在細胞內形成的不溶性蛋白質聚集物，通常是因為蛋白質未能正確折疊或是由于蛋白質表達水平過高。適當的密碼子優化可以幫助調控蛋白質的表達速率，減少包涵體的形成，提高目標蛋白的正確折疊和可溶性表達。
（2）GC含量
理想的GC含量通常在40%-60%之間。過高的GC含量可能導致mRNA二級結構過于穩定，過低則可能影響轉錄效率。
（3）mRNA二級結構
復雜和穩定的二級結構會影響翻譯效率，特別是序列中有和核糖體結合位點或翻譯起始位點互作的序列，會阻止翻譯的進行，合理優化翻譯起始區的mRNA二級結構，可提高蛋白表達水平。
擎科生物獨有的 GeneOptimizer 軟件密碼子優化算法是不僅局限于密碼子層面的序列深度優化技術。支持上萬種宿主優化和定制化服務。優化的主要參數包括：密碼子偏好性、GC 含量、減少poly（A） 結構、重復序列、核糖體結合位點、酶切位點等。在保證密碼子適應指數CAI和GC含量處在合理范圍內，盡可能減少其他負面因素的影響，求得帕累托最優解，進而完成對基因表達的優化。擎科生物可為基因合成客戶提供免費的密碼子及序列優化服務。
通過自動化序列分析評估軟件在不到一次眨眼的時間就能完成一個準確的序列優化（0.1s/個）。
擎科生物自主開發的自動化方案設計軟件，根據載體和序列特點可批量設計多種高效構建方案，提高載體構建成功率。
案例分享：
（1）目標蛋白16.8 kDa，密碼子優化前蛋白不表達，密碼子優化后蛋白大量表達。
（2）目標蛋白100 kDa，密碼子優化前包涵體表達，密碼子優化后上清可溶表達75%。
[1] Sharp, P. M., & Li, W. H. (1987). "The Codon Adaptation Index—a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications." Nucleic Acids Research, 15(3), 1281-1295.
[2] Gustafsson, C., Govindarajan, S., & Minshull, J. (2004). "Codon bias and heterologous protein expression." Trends in Biotechnology, 22(7), 346-353.
